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1. 荧光定量pcr内参基因跟目的基因
mirna的荧光定量pcr可以用actin做内参miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。我知道和使用过的U6内参基因只有两个：
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RNU6-1和RNU6-2.前一个就是常见的u6,后一个有时被称为u6b.在我的大鼠RNA样本当中,u6表达量有些太高,u6b的Cq值与我的目标miRNA比较接近,稳定性也很好.但是这些对植物样本中的内参基因选择没有什么指导意义.为了确定u6在植物中的保守性,比较快捷的办法是找到谈论这个话题的文献综述.如果没有人写过这样的综述的话,就只能靠自己去数据库找到所有序列自己对比了.关于内参基因的选择,必须实验确定特定样本中的表达水平稳定,其他文献中报导的内参基因不一定适合你的样本.做新的课题时,选择内参基因一般是选取3-5个常用的,PCR测试后选取.2. 荧光定量pcr内参基因跟目的基因一样吗
半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。
1. 半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
2. 定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。
半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR需要跑电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低，而定量RT-PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低。
荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.BIOG染料法荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料或者和目的DNA片段结合的BIOG taqman,通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.
半定量rt-pcr参照的做法一般有两种：
1) 将要比较的两个样品的beta-actin 调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。
2) 不进行调平，一个样品里将目的基因和beta-actin直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简单，但结果不够直观。
1.每个标本都要做自己的内参，不能用同一个内参！
2.每个标本在实际做前都要摸最佳循环数，包括内参，但内参的循环数不一定要和目的基因一样，都要选择上升期的中间数作为最佳循环数，否则进入平台期就没有可比性了！所以内参要有它自己的最佳循环数！
3.电泳扫描后，计算灰度值，先用同一标本的内参和目的进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组4个样本以上。
3. 荧光定量内参基因作用
ct= -k lgx0+ b（线性方程）用这个方程可以通过ct值算出样品的起始浓度
斜率=-1/lg(1+e)
扩增效率e=1, 斜率=-3.32
扩增效率范围：90%-110%
斜率范围：-3.1和-3.59之间
△△ct这是相对荧光定量的一个计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率
例如，想看a基因和b基因在某细胞系中表达量的差别，选取18s作为内参基因，就用a基因的ct值减去18s的ct值，得到△ct1，用b基因的ct值减去18s的ct值得到△ct2，然后用△ct1-△ct2=△△ct，而a，b基因的表达量差别为2（-δδct）次方，当然这中计算方法是基于荧光定量的数学计算模型简化来的，平时随便用用没什么问题，如果你的两个目的基因的扩增效率不一样，这个计算方法是不能用的。
4. 荧光定量pcr内参基因是什么
应该叫pcr内参引物，指的是进行定量pcr分析基因表达水平差异时所选用的参照基因的引物。
1、用途不同
引物：用于pcr扩增
探针：用于标记扩增产物
2、本质不同
引物：是一小段DNA或RNA，作用是在扩增中作为核苷酸链延伸的起点。
探针：带可检测的荧光分子，能特异性结合扩增产物，发出荧光信号被仪器检测到。
3、设计原则不同
最大区别如引物不能含有自身互补的序列，防止形成发夹结构。而探针，如分子信标，特别设计了互补序列以形成发夹结构。
5. 荧光定量pcr内参基因跟目的基因的区别
Pcr目的基因的计算必须需要一个内参作为参照。内参的浓度一般是一定的，然后相对于内参浓度，即可算出目的基因的浓度。
6. 荧光定量pcr是基因检测么
1、核酸的基础研究：基因组克隆
2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序
3、反向PCR测定未知DNA区域
4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA
5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控
6、cDNA末端快速扩增技术
7、检测基因的表达
8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。
7. pcr内参基因的意义
ROX内参染料，用于消除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度的提高了扩增的准确性
内参基因是为了平衡不同模板之间的差异，而ROX在不断的加热退火过程中的荧光比较稳定，用以做为体系中的阳性较正。
ROX不参与PCR反应，仅消除加样误差和仪器孔之间误差作用。
内标的作用：内标探针与标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
ROX的作用：用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确
8. 荧光定量pcr内标与内参的区别
内标即内部标准之意，指在定量分析中添加于检材内的一种适 当的化合物纯品，其测得值是计算被测组分 含量的参比依据。
在毒（药）物分析中，为 了保证操作符合检测方法的要求，常常选择 一种适当的化合物纯品作为随行参比物，添加已知量于检材中，跟随被测组分-起进行 前处理，最后同时分别检测被测组分和参比物，根据参比物的回收情况判断前处理过程的效率及仪器等检测条件是否正常。
而内参是与目的基因加于同一反应管中，与目的基因同时进行扩增。
9. 荧光定量内参和目的基因ct值
每个样品必须要用其对应的内参值。比如说，我有AB两个样品，计算A的**ct值时一定要用A样品所得的内参值。此外，每一次定量实验都得做内参，而不能使用上一次实验的。
10. 荧光定量pcr基因表达量
如果检测一个或者少数mRNA的话，可以提取总RNA之后反转录，用荧光定量pcr检测其表达量。
如果需要检测大量基因的表达的话，用基因芯片或者转录组测序会比较好
11. 荧光定量pcr管家基因
qPCR的结果中各个参数都有意义如下，
RQ:相对量值
RQ Min：相对量值最小值
RQ Max：相对量值最大值
CT：阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环圈数
CT mean：CT值的平均值
CT SD：CT值的标准偏差
△CT：某个组织/样品中管家基因与目的基因扩增片段CT值的差值
△CT mean：△CT的平均值
△CT SE（应该是SD吧）：△CT的标准偏差
△△CT：最后的相对定量的结果，即2的△△CT次方。
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