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1. 亲水相互作用色谱吸附分配机制
纸色谱法基本原理：
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纸纤维为载体，吸着在其上的水为固定相，属于正相分配色谱，依据分配系数的不同而达到分离，极性或亲水性强的组分，K大，Rf值小，极性弱或亲脂性强的组分，K小，Rf值大。
纸色谱法指的是把一种溶剂固定在固体的支持物上，由于滤纸纤维对水有较强的亲和力，一般能吸附其自身质量22%的水，其中，6%的水以氢键与纤维素牢固结合，这些水即称为固定相。
被水饱和的有机相 为流动相。当流动相从含有氨基酸样品的滤纸上流过时，氨基酸就在固定相与流动相之间连续进行分配。
2. 亲水色谱原理介绍
SH-AC-6是用于专门分析易极化阴离子的色谱柱，适合分析I、SCN- 、S2O32-、CLO4-，峰性尖锐对称性好。
SH-AC-7是用于快速阴离子分析，6分钟以内能够完成7种常规阴离子分析。
SH-AC-8属于中等亲水型阴离子色谱柱，是用于快速阴离子分析和溴酸盐分析，可同时分析溴酸盐和常规7种阴离子。
SH-AC-9属于亲水型阴离子色谱柱，适用于碳酸根体系分析测试常规7种阴离子，特别是F与水负峰具有良好的分离效果。
SH-AC-10属于亲水型阴离子色谱柱，适用于氢氧根体系分析常规10种阴离子，可搭配淋洗液发生器使用。
3. 亲水作用色谱原理
RPLC是反相液相色谱法（reverse-phase liquid chromatography）是代谢组学中先常见和实用的一种LC分离方法。但是他的缺点是对于强极性物质保留较差。亲水相互作用液相色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。它通过采用强极性度固定相，并且结合高比例有机相和低比例水相作为流动相。
4. 疏水性相互作用色谱的分离机理
反相液相色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关．反相色语法是以表面非极性载体为固定相，面以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300。
5. 亲水相互作用色谱原理
1、适合亲水性化合物的分离；
2、流动相可以使用100%的水溶液；
3、具有与优常规的ODS色谱柱不同的选择性。
6. 亲和色谱的分离机制
亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
1.抗原和抗体
利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。
例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。
将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。
另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。
2.生物素和亲和素
生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力,这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。
另外,可以利用生物素和亲和素间的高亲和力,将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用,通过生物素与亲和素的亲和力,胰岛素就被固定在琼脂糖上,可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂(如生物素与NHS生成的酯)作用结合上生物素,并且不改变其生物活性,这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。
3.维生素、激素和结合转运蛋白
通常结合蛋白含量很低,如1000升人血浆中只含有20毫克Vit -7-10-B12结合蛋白,用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力(解离常数为10 16M)而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强,所以洗脱时可能需要较强烈的条件,另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。
4.激素和受体蛋白
激素的受体蛋白属于膜蛋白,利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质,难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10 6-10? 12M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。
5.凝集素和糖蛋白
-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样,用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。a-D-甲基甘露糖苷或a-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合,可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物,就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。
如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用a-D-吡喃甘露糖苷或a凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白,几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖,因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。
6.辅酶
核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子,利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶,包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛,可以用于分离各种激酶和脱氢酶。
7.多核苷酸和核酸
利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。
8.氨基酸
固定化氨基酸是多用途的介质,通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力,或者通过氨基酸的疏水性等性质,可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L-精氨酸可以用于分离羧肽酶,L-赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。
9.染料配体
结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构,所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力,可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用,使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。
10.分离病毒、细胞
利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用,亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞,胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强,所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB,颗粒大、非特异性吸附小,适合用于细胞亲和层析。
11.金属螯合色谱
金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸(IDA)等螯合剂,它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用,生成带有多个配位基的金属螯合物,可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如Cu2+-IDA配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。
12.共价色谱
共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附,而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基-Sepharose、巯丙基-Sepharose等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上,通过适当的洗脱液如半胱氨酸,巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和,可以多次重复使用。
7. 一般用亲水性吸附剂做色谱分离时
乳化剂是能够改善乳浊液中各种构成相之间的表面张力，使之形成均匀稳定的分散体系或乳浊液的物质。
乳化剂是表面活性物质，分子中同时具有亲水基和亲油基，它聚集在油/水界面上，可以降低界面张力和减少形成乳状液所需要的能量，从而提高乳状液的能量。
常用乳化剂有以下几种：
食品乳化剂
天然乳化剂
聚丙烯酰胺乳化剂
20世纪60年代以来，人们开始重视表面活性剂使用的安全性，加强了对无毒、生物降解性好的非离子乳化剂的研究。
在食品、化妆品、医药等行业限制某些乳化剂的使用，开发出山梨酸醇脂肪酸酯类、磷脂类、糖脂类乳化剂等新型乳化剂。
乳化剂是指能够使乳浊液稳定的表面活性剂。因此，在油水体系中加入乳化剂后，水和油就能相互混合，形成完全分散的乳浊液。乳化剂不仅仅能够提高乳浊液的稳定性，还能够决定乳浊液的类型。
乳化剂的亲水性和亲油性一般是不平衡的，它们适用的场合也有所差异，如果乳化剂分子的亲水基比亲油基大而强，属于亲水性的乳化剂，易形成水包油(O/W)型乳浊液；
相反，如果乳化剂分子的亲油基团比亲水基大而强，它则属于亲油性的乳化剂，易形成油包水(W/O)型乳浊液。一般的，亲水性强的乳化剂适用于O/W型乳浊液，亲油性强的乳化剂适用于W/O型乳浊液。
一般可用“亲水亲油平衡值”（即HLB）来表示其乳化能力的差别。若HLB愈大，则亲水作用愈大，即可稳定水包油型乳化体；反之，HLB愈小，则亲油作用愈大，即可稳定油包水型乳化体。
乳化剂根据其结构和性质都不相同，乳化剂可分为阴离子型、阳离子型和非离子型；
根据其来源可分为天然乳化剂和合成乳化剂；
按照作用类型可以分为表面活性剂、黏度增强剂和固体吸附剂；
按其亲油亲水性可分为亲油型和亲水型
8. 亲水作用色谱分离原理
亲水作用色谱的流动相是：
在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。
水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。
9. 亲水相互作用液相色谱
优先选择HILIC色谱柱，AQ色谱柱只是在反相填料基础上增强对极性分子的保留，但改善效果有限，而HILIC则是基于亲水作用的分离机理，使得大极性物质也可以在色谱柱上保留。
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