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大肠杆菌检验（包括(一)检验方法；(二)培养基 ）
(一)检验方法
1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革
兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。
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(二)培养基
①乳糖胆盐发酵培基
成分：蛋白胨：20g
猪胆盐(或牛，羊胆盐)：5g
乳糖:10g
0．04％溴甲酚紫水溶液: 25m1
蒸馏水: 1 000m1
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管l 0ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。
用途：乳糖发酵试验用。
原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。
乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。
糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。
大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。
注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)
②伊红美蓝琼脂培基
成分：蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 17g
2％伊红Y溶液 20ml
0．65％美蓝溶液 10ml
蒸馏水 1000ml
pH7.1
制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。
③乳糖发酵培基
成分：蛋白胨 20g
乳糖 10g
O．04％溴甲酚紫水溶液 25ml
蒸馏水 1000ml
pH7．4
制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注： ’
(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群
证实试验用。
4．蛋白胨水
成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1 000ml pH7．4
总酸度是指食品中所有酸性成分的总量。它包括未离解的酸的浓度和已离解的酸的浓度，其大小可借标准碱滴定来测定。有效酸度是指被测溶液中H＋的浓度，准确地说应是溶液中H＋的活度，所反映的是已离解的那部分酸的浓度，常用pH值表示。pH是氢离子浓度的负对数，pH =－Log ［H＋］。20℃的中性水，其离子积为［H＋］ ［OH－］ = 10－14。在酸性溶液中pH＜7，在碱性溶液中pH＞7，在中性溶液中pH=7。测定pH的方法有电位法、比色法和化学法等。通常采用酸度计法测定。一、实验目的掌握食品中总酸度与有效酸度的测定方法和pH计的使用方法。二、实验原理1．总酸度的测定食品中的有机弱酸在用标准碱液滴定时，被中和生成盐类。用酚酞作指示剂，当滴定至终点(pH=8．2，指示剂显红色)时，根据耗用标准碱液的体积，可计算出样品中总酸含量。其反应式如下：RCOOH + NaOH——→RCOONa+ H2O2．有效酸度的测定pH计由一支能指示溶液pH的玻璃电极作指示电极，以甘汞电极作参比电极组成一个电池。它们在溶液中产生一个电动势，其大小与溶液中的氢离子浓度有直接关系。E = ＋ 0.0591 Log ［H＋］ = －0.0591pH即每相差一个pH单位就产生59.1mV的电极电位。由pH计表头上直接读出样品溶液的pH值。三、仪器和试剂1．仪器：滴定装置 1套25mL 碱式滴定管 1支pH计 1台100mL烧杯 3个100mL容量瓶 3个2. 试剂： 0.1mol／L NaOH标准溶液：称取氢氧化钠(AR)120g于250mL烧杯中，加入蒸馏水100mL，振摇使其溶解，冷却后置于聚乙烯塑料瓶中，密封，放置数日澄清后，取上清液5.6mL，加新煮沸过并已冷却的蒸馏水至1000mL，摇匀。四、实验方法1．总酸度的测定标定：精密称取0.6g (准确至0.0001g)在105～110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加50mL新煮沸过的冷蒸馏水，振摇使其溶解，加2滴酚酞指示剂，用配制的NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色30秒不褪。同时做空白试验。计算：C = 式中：C——氢氧化纳标准溶液的摩尔浓度，mol /L；——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V1——标定时所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——空白试验中所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL；204.2——邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量, g／mol。② 1％酚酞乙醇溶液：称取酚酞1g溶解于100mL95％乙醇中。4．操作方法(1)样液制备①固体样品、干鲜果蔬、蜜饯及罐头样品；将样品用粉碎机或高速组织捣碎机捣碎并混合均匀。取适量样品(按其总酸含量而定)，用15mL 无CO2蒸馏水(果蔬干品须加8～9倍无CO2蒸馏水)将其移入250mL容量瓶中，在75～80℃水浴上加热0.5h(果脯类沸水浴加热1h)．冷却后定容，用干燥滤纸过滤，弃去初始滤液25mL，收集滤液备用。②含CO2的饮料、酒类：将样品置于40℃水浴上加热30min，以除去CO2，冷却后备用。③调味品及不含CO2的饮料、酒类：将样品混匀后直接取样，必要时加适量水稀释(若样品混浊，则需过滤)。④咖啡样品：将样品粉碎通过40目筛，取10g粉碎的样品于锥形瓶中，加入75mL 80％乙醇，加塞放置16h，并不时摇动，过滤。⑤固体饮料：称取5～l 0g样品，置于研钵中，加少量无CO2蒸馏水，研磨成糊状，用无CO2蒸馏水转入250mL容量瓶中，充分振摇，过滤。 (2)滴定准确吸取样液50mL，加入酚酞指示剂3～4滴，用0.1mol／L NaOH 标准溶液滴定至微红色30秒不褪，记录消耗0.1mol／L NaOH 标准溶液mL数。4-2．有效酸度的测定5．结果计算总酸度(％) = 式中：C——标准NaOH溶液的浓度，mol /L；V——滴定消耗标准NaOH标准液体积，mL；——样品质量或体积，g或mL；V0——样品稀释液总体积，mL；V1——滴定时吸取的样液体积，mL；K——换算为主要酸的系数，即1毫摩尔氢氧化钠相当于主要酸的克数。因食品中含有多种有机酸，总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。一般分析葡萄及其制品时，用酒石酸表示，K= 0.075；分析柑桔类果实及其制品时，用柠檬酸表示，K= 0.064或0.070(带一分子水)；分析苹果、核果类果实及其制品时，用苹果酸表示，K= 0.067；分析乳品、肉类、水产品及其制品时用乳酸表示，K= 0.090；分析酒类、调味品时，用乙酸表示，K= 0.0 60。2．有效酸度的测定(1)．样品的准备①果蔬样品的制备：将水果或蔬菜压榨后，取其压榨汁直接进行pH测定。②肉类样品的制备：称取l0克已除去油脂并绞碎的样品，放入加有100毫升新煮沸冷却的蒸馏水的锥形瓶中，浸泡15分钟(随时摇动)。然后用干滤纸过滤，所得滤液进行pH 测定。(2)．pH计的校正①玻璃电极预先在蒸馏水中浸泡24h以上，使电极活化。②用标准缓冲溶液洗涤两次烧杯和电极，然后将适量标准缓冲溶液注入烧杯内，将电极浸入溶液中，使玻璃电极上玻璃珠及参比电极的毛细管浸入溶液，小心缓慢摇动烧杯。③根据样液温度调节酸度计温度补偿旋钮，使温度补偿器旋钮尖头指示样品溶液之温度。④根据缓冲溶液选择“pH”范围。⑤将电极接头同仪器相联(甘汞电极接入接线柱，玻璃电极接入插孔内)。⑥调节“选择”调节器使指针在pH 位置。将“斜率”旋钮旋至最大。⑦将复合电极插入pH=6.86缓冲液中，3～5min后，调节电位调节器，使显示缓冲溶液的pH值6.86。⑧将电极取出，用蒸馏水冲洗电极，用滤纸吸干水珠，插入另一缓冲液4.01中，调节“斜率”旋钮，使出现数值4.01。重复调节。校正后切勿再旋动定位调节器。(3). pH测量①先用去离子水冲洗电极和烧杯，用滤纸吸干电极表面水分。再用样品试液洗涤电极和烧杯。然后将电极浸入样品试液中，轻轻摇动烧杯，使溶液均匀。②调节温度补偿器至被测溶液温度。③按下读数开关，稳定1min后，酸度计指针所指之值即为样品试液的pH值。④测量完毕后，取下电极清洗干净。将电极护帽套上放好。帽内应放少量补充液，以保持电极球泡的湿润。将电极和烧杯洗干净并妥善保存。 五、注意事项1．样液制备方法、浸渍与稀释用水量和滴定方法等应根据样品中总酸含量来慎重选择，为使误差不超过允许范围，一般要求滴定时消耗0.1mol /L NaOH溶液不得少于5mL，最好在10～15mL。2．由于食品中有机酸均为弱酸，在用强碱(NaOH )滴定时，其滴定终点偏碱性，一般在pH8.2左右，故可选用酚酞作终点指示剂。3．若样液带有颜色，则在滴定前用与样液同体积的不含CO2蒸馏水稀释之或采用试验滴定法，即对有色样液，用适量无CO2蒸馏水稀释，并按100mL样液加入0.3m1酚酞比例加入酚酞指示剂，用标准NaOH溶液滴定近终点时，取此溶液2～3mL移入盛有20m1无CO2蒸馏水中(此时，样液颜色相当浅，易观察酚酞的颜色)，若试验表明还没达到终点，则将此稀释的样液倒回原样液中，继续滴定至终点出现为止。若样液颜色过深或浑浊，则宜用电位滴定法测定。4．各类食品的总酸度以主要酸表示。
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